Probenvorbereitung


1.) Protein-Kristallisation

Wir bieten für die akademische Nutzung für Angehörige der HHU sowie externe Nutzer ein breit gefächertes Screening nach Kristallisationsbedingungen für lösliche Proteine sowie für Membranproteine im „Sitting drop“-Verfahren an. Wir können in diesem ersten Screening bis zu 2500 verschiedene Bedingungen abdecken. Unsere Leistung beinhaltet die Beratung, das Ansätzen der Experimente sowie die Dokumentation und Auswertung über einen Zeitraum von 4 Wochen. Es können Screens mit dem Apo-Protein als auch Co-Kristallisationsexperimente mit Protein plus Substrat(en) durchgeführt werden. Für das Screening berechnen wir Ihnen lediglich die Materialkosten (z. B. Kristallisationsplatten, Versiegelungsfolie, Spitzen, Screening-Kits, Feinchemikalien).

 

Um ein optimales Screening und gute Reproduzierbarkeit gewährleisten zu können, müssen einige Faktoren beachtet werden bzw. Unterlagen/Reagenzien beigefügt werden (siehe auch undefinedAuftragsformular):

  1. Der niedrigmolare Proteinpuffer sollte so wenig Agenzien wie möglich enthalten (gerade so viel, dass das Protein stabil ist; möglichst kein Phosphatpuffer)
  2. Das Protein muss sauber (min. zu 90 % in der SDS-PAGE) und homogen sein (nur ein oligomerer Zustand)
  3. Das Protein muss über mind. 3 Wochen stabil sein (bei 4 °C, 12 °C oder 20 °C)
  4. Mindestkonzentration an Protein: 5 – 10 mg/ml
  5. Mindestvolumen an Proteinlösung pro Screen (96 Bedingungen): 15 µl
  6. Bitte etwa 2 ml Proteinpuffer mit Angaben über die Zusammensetzung beifügen

Darüber hinaus sind einige weitere Angaben für unsere Experimente notwendig:

  1. Datum der Proteinreinigung und Lagerbedingungen (Temperatur)
  2. Abbildung SDS-PAGE
  3. Homogenitätsnachweis (z. B. Abbildung Gelfiltration)
  4. Proteinkonzentration, Molekulargewicht und -Pufferzusammensetzung
  5. Sofern bestimmte Zusätze (z. B. Metall-Ionen, Cofaktoren etc.) für die Aktivität oder Stabilität essentiell sind, bitte angeben
  6. Gibt es einen Aktivitätstest? Wenn ja: ist das Protein im verwendeten Puffer aktiv?
  7. Bei Co-Kristallisation: Angaben über das/die Substrat(e) und geeignete Konzentration(en). Sind die Substrat(e) nicht kommerziell erhältlich, müssen diese vom Nutzer bereitgestellt werden.

Auf Anfrage bieten wir weiterführende Experimente an: angefangen bei der Optimierung von Kristallisationsbedingungen, Suche nach Cryo-Bedingungen für Diffraktionsmessungen, Testmessungen von Kristallen an der Hausanlage, Datensammlung am Synchrotron bis hin zur Strukturlösung.

 

Zur Klärung noch offener Fragen oder zur Terminabsprache kontaktieren Sie uns bitte.


2.) SAXS-Messungen (Proteine)

 

Für die akademische Nutzung bieten wir für Angehörige der HHU sowie für externe Nutzer die Möglichkeit, SAXS Messungen durchzuführen. Das CSS ist ausgestattet mit einem Xeuss 2 in-house SAXS-Gerät der Firma Xenocs. Der Detektorabstand kann zwischen 260 mm bis 2500 mm variiert werden. Es steht eine Cu-Quelle mit einer Wellenlänge von 1.5 Å zu Verfügung. Die Probenkammer kann sowohl unter atmosphärischem Druck als auch unter Vakuum genutzt werden. Für die Messungen stehen Kapillaren sowie Knopfzellen zur Verfügung. Ebenso besteht für biologische Proben die Möglichkeit, diese in einer temperierbaren Flusszelle zu messen und/oder automatisiert mittels eines temperierbaren Probenwechslers zu injizieren.

Für eine bevorstehe Messung müssen einige Faktoren beachtet werden bzw. Unterlagen/Reagenzien beigefügt werden (siehe auch undefinedAuftragsformular):

  1. Der niedrigmolare Proteinpuffer sollte so wenig Agenzien wie möglich enthalten (gerade so viel, dass das Protein stabil ist; kein Phosphatpuffer und maximal 5 % Glycerin)
  2. Das Protein muss sauber (min. zu 95 % in der SDS-PAGE) und homogen sein (nur ein oligomerer Zustand)
  3. Das Protein muss über mind. 2 Tage stabil sein (bei 4 °C, 12 °C oder 20 °C)
  4. Mindestkonzentration an Protein: 5 - 10 mg/ml
  5. Mindestvolumen an Proteinlösung pro Messung: 70 µl
  6. Bitte etwa 2 ml Proteinpuffer mit Angaben über die Zusammensetzung beifügen. (Wichtig: Es muss exakt derselbe Puffer sein, in dem das Protein gereinigt/dialysiert/konzentriert wurde, um genaue Intensitätswerte zu erhalten!)

Darüber hinaus sind einige weitere Angaben für unsere Experimente notwendig:

  1. Datum der Proteinreinigung und Lagerbedingungen (Temperatur)
  2. Abbildung SDS-PAGE
  3. Homogenitätsnachweis (z. B. Abbildung Gelfiltration)
  4. Proteinkonzentration, Molekulargewicht, Extinktionskoeffizient und Pufferzusammensetzung
  5. Sofern bestimmte Zusätze (z. B. Metall-Ionen, Cofaktoren etc.) für die Aktivität oder Stabilität essentiell sind, bitte angeben
  6. Proteinsequenz inkl. Tags und Schnittstellen (Textfile)
  7. Sofern vorhanden: Struktur oder Homologiemodel

Zur Klärung noch offener Fragen oder zur Terminabsprache kontaktieren Sie uns bitte.

 

 

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