Probenvorbereitung


1.) Protein-Kristallisation

Wir bieten für die akademische Nutzung für Angehörige der HHU sowie externe Nutzer ein breit gefächertes Screening nach Kristallisationsbedingungen für lösliche Proteine sowie für Membranproteine im „Sitting drop“-Verfahren an. Wir können in diesem ersten Screening bis zu 2500 verschiedene Bedingungen abdecken. Unsere Leistung beinhaltet die Beratung, das Ansätzen der Experimente sowie die Dokumentation und Auswertung über einen Zeitraum von 4 Wochen. Es können Screens mit dem Apo-Protein als auch Co-Kristallisationsexperimente mit Protein plus Substrat(en) durchgeführt werden. Für das Screening berechnen wir Ihnen lediglich die Materialkosten (z. B. Kristallisationsplatten, Versiegelungsfolie, Spitzen, Screening-Kits, Feinchemikalien).

 

Um ein optimales Screening und gute Reproduzierbarkeit gewährleisten zu können, müssen einige Faktoren beachtet werden bzw. Unterlagen/Reagenzien beigefügt werden (siehe auch undefinedAuftragsformular):

  1. Der niedrigmolare Proteinpuffer sollte so wenig Agenzien wie möglich enthalten (gerade so viel, dass das Protein stabil ist; möglichst kein Phosphatpuffer)
  2. Das Protein muss sauber (min. zu 90 % in der SDS-PAGE) und homogen sein (nur ein oligomerer Zustand)
  3. Das Protein muss über mind. 3 Wochen stabil sein (bei 4 °C, 12 °C oder 20 °C)
  4. Mindestkonzentration an Protein: 5 – 10 mg/ml
  5. Mindestvolumen an Proteinlösung pro Screen (96 Bedingungen): 15 µl
  6. Bitte etwa 2 ml Proteinpuffer mit Angaben über die Zusammensetzung beifügen

Darüber hinaus sind einige weitere Angaben für unsere Experimente notwendig:

  1. Datum der Proteinreinigung und Lagerbedingungen (Temperatur) bitte angeben
  2. Abbildung SDS-PAGE bitte beifügen
  3. Homogenitätsnachweis (z. B. Abbildung Gelfiltration) bitte beifügen
  4. Proteinkonzentration, - Molekulargewicht und -Puffer bitte angeben
  5. Sofern bestimmte Zusätze (z. B. Metall-Ionen, Cofaktoren etc.) für die Aktivität oder Stabilität essentiell sind, bitte angeben
  6. Gibt es einen Aktivitätstest? Wenn ja: ist das Protein im verwendeten Puffer aktiv?
  7. Bei Co-Kristallisation: Angaben über das/die Substrat(e) und geeignete Konzentration(en). Sind die Substrat(e) nicht kommerziell erhältlich, müssen diese vom Nutzer bereitgestellt werden.

Auf Anfrage bieten wir weiterführende Experimente an: angefangen bei der Optimierung von Kristallisationsbedingungen, Suche nach Cryo-Bedingungen für Diffraktionsmessungen, Testmessungen von Kristallen an der Hausanlage, Datensammlung am Synchrotron bis hin zur Strukturlösung.

 

Zur Klärung noch offener Fragen oder zur Terminabsprache kontaktieren Sie uns bitte.


2.) SAXS-Messungen (Proteine)

Das Protein sollte in hoher Reinheit und homogen vorliegen (nur ein oligomerer Zustand) mit einer Konzentration von 2-5 mg/ml. Bitte eine Abbildung des SDS-Gels und eines Gelfiltrationsprofils beilegen.

Beim Proteinpuffer sollte der Glyzeringehalt nicht mehr als 5 % betragen. Bekannte oder geeignete Liganden oder Substrate sollen als Pulver mitgeliefert werden, da diese im gleichen Puffer wie das Protein gelöst werden. Bitte geben Sie auch geeignete Konzentrationen für den/die Liganden bzw. Substrate an.

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